Беременность: диагностика хромосомных аномалий. Эффекты хромосомных аномалий в онтогенезе. Развитие людей с ХА

Беременность: диагностика хромосомных аномалий. Эффекты хромосомных аномалий в онтогенезе. Развитие людей с ХА

Проблема невынашивания беременности является актуальной и социально значимой. Причины невынашивания беременности многочисленны. Они могут быть вызваны генетическими (генные, геномные и хромосомные мутации, иммунологическая несовместимость) и негенетическими (заболевания матери, химические и физические воздействия) факторами [5]. Известно, что 10–15 % клинически диагностированных беременностей останавливаются в развитии на ранних этапах эмбриогенеза. Около 50 % случаев ранней остановки развития и внутриутробной гибели эмбриона обусловлено хромосомными аномалиями, такими как аутосомные трисомии, полиплоидия, моносомия Х хромосомы и несбалансированные структурные перестройки [5,9]. Большинство из этих отклонений являются спорадическими и возникают de novo. Генетический анализ тканей плода имеет большое значение для установления основной причины невынашивания беременности, выбора дальнейшей тактики обследования женщины, планирования и наблюдения последующих беременностей [4,8].

В настоящей работе для определения хромосомного статуса эмбриона при репродуктивных потерях использован метод метафазной сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization – CGH), который также называют «молекулярным кариотипированием». Этот метод позволяет провести анализ всего генома в рамках одного исследования.

CGH-анализ основан на одновременной гибридизации опытной и контрольной (полученной от нормального индивидуума) ДНК, меченных двумя разными флюорохромами, на хромосомный препарат из культуры лимфоцитов здорового донора. Путем сравнения относительной интенсивности флюоресценции двух флюорохромов по всей длине каждой хромосомы выявляется геномный дисбаланс в виде дупликации или делеции [1,2]. Ограничением применения CGH для анализа тканей плода при репродуктивных потерях является неинформативность этого метода при кратном увеличении генома (триплоидия, тетроплодия). Чтобы преодолеть это ограничение и повысить эффективность анализа, в дополнение к CGH мы использовали интерфазную флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) с ДНК-зондами на центромерные районы хромосом 18, Х и Y в интерфазных ядрах для определения плоидности [3,9].Такой подход позволяет выявить практически все числовые и несбалансированные структурные хромосомные перестройки размером более 4 м.п.н., в том числе ассоциированные с репродуктивными потерями, а также избежать трудности, связанных с получением хромосомных препаратов для цитогенетического анализа.

Оценка эффективности выявления и определение спектра ХА методами молекулярного кариотипирования.

Материалы и методы

Исследовано 146 образцов ткани хориона (плаценты), полученных после прерывания беременности. Показаниями для прерывания являлись: неразвивающаяся беременность (n=131), анэмбриония (n=8) и врожденные пороки у плода, ВПР (n=7) в сроке от 4 до 20 недель беременности. Средний возраст женщин составил 32,3±4.6 года.

Во всех случаях хорион был визуально оценен, тщательно отобран от материнских тканей и отмыт от примесей крови.

От каждого образца 5–10 мг ворсин хориона использовали для получения отпечатков ткани с последующей обработкой [6]. Из остального материала выделяли ДНК методом экстракции фенол-хлороформом для проведения сравнительной геномной гибридизации.

ДНК плода (опытная) и референсная ДНК (контрольная) мечены в реакции ник-трансляции SpectrumGreen dUTP и SpectrumRed dUTP (AbbottMolecular, США) по стандартному протоколу [2]. Платформой для совместной гибридизации опытной и референсной ДНК служили хромосомные препараты из культуры лимфоцитов периферической крови доноров – мужчин с нормальным кариотипом. Реакцию сравнительной геномной гибридизации и постгибридизационную отмывку проводили по протоколу фирмы производителя (AbbottMolecular, США). Для контрокрашивания хромосом использовали DAPI I (AbbottMolecular, США) в растворе Vectashield (VectorLabs, США) в соотношении 1:20.

Анализ изображений метафазных хромосом проводили на эпифлуоресцентном микроскопе «Eclipse90i» (Nikon, Япония), оборудованном CCD камерой «ProgResMF» (JENOPTIK) и программой обработки изображения «LuciaCGH» (Чехия). Для каждого образца анализировали 10–15 метафазных пластинок.

FISH анализ интерфазных ядер с ДНК зондами: SE2 (D2Z2), SE4 (D4Z1), SE10 (D10Z1), SE 15 (D15Z4), SE 16 (D16Z2), SE18 (D18Z1), SE 20 (D20Z1), SE (XY18), SE (X,Y), PN13 (13q14), PN 21 (21q22), Sub-Telomere5qter (D5S2006), Sub-Telomere 6qter (D6S2523), Sub-Telomere9pter (D9S917), Sub-Telomere9qter (D9S1838), Sub-Telomere11qter (D11S4437), Sub-Telomere20pter (D20S1156), Sub-Telomere 20qter (RH44234), Sub-Telomere22qter (D22S1056) (Kreatech, Нидерланды) проводили по протоколам фирмы – производителя. Анализ осуществляли на эпифлуоресцентном микроскопе «AxioImagerM.1» (CarlZeiss, Германия) c соответствующим набором светофильтров и с использованием компьютерной программы обработки цифровых изображений «Isis» (MetaSystems, Германия).

Результаты и обсуждение

Из всех образцов хориона получено достаточное для анализа количество ДНК, и проведена сравнительная геномная гибридизация.

При отсутствии хромосомного дисбаланса плоидность определяли при проведении FISH с ДНК зондами на центромерные районы хромосом 18, Х и Y. Все случаи обнаружения дисбаланса при CGH подтверждались с помощью интерфазной FISH с соответствующими локус-специфичными или центромерными зондами.

Из 146 наблюдений, хромосомный и геномный дисбаланс не обнаружен в 71 случае, что составило 48,6 %. Различные ХА выявлены в 75 случаях. Таким образом, частота ХА при невынашивании беременности составила 51,4 %. Спектр выявленной хромосомной патологии включал практически все типы ХА, приводящие к антенатальной гибели плода, кроме моносомии по аутосомам и тетраплоидии (табл. 1).

Среди 75 случаев хромосомной патологии в 58,7 % (44 образца) выявлена трисомия по аутосомам. Триплоидия определена в 22,7 % случаев (n=17), из них: в 9 случаях дигенического (ХХХ), а в 8 – диандрического (ХХY) происхождения. Моносомия Х диагностирована в 7 наблюдениях (9,3 % от всех ХА). Сочетанная хромосомная патология выявлена в 3 наблюдениях (4 % от всех ХА) и представлена двойной трисомией по хромосомам 9 и 16, моносомией Х в сочетании с трисомией по 22 хромосоме и моносомией Х с частичной трисомией 6q.

Геномный дисбаланс в виде делеции и/или дупликации терминальных районов хромосом диагностированы в 4 наблюдениях (5,3 %) при наличии ВПР у плода. В 2 случаях, при частичной трисомии по длинному плечу хромосомы 20 у плода и частичной трисомии по длинному плечу хромосомы 22/частичной моносомии по длинному плечу хромосомы 11 установлено, что причиной аномального фенотипа у плода являлся геномный дисбаланс вследствие патологической мейотической сегрегации хромосом при аутосомной реципрокной транслокации у родителя-носителя – 46,XY,t(16;20)(p13.3;q13.13) и 46,XX,t(11;22)(q23.3;q12.2), соответственно. Важно отметить, что в случае t(16;20)(p13.3;q13.13) при CGH не выявлена делеция района 16q13.3-qter из-за ограничения разрешающей способности метода, поскольку размер транслоцированного сегмента не превышает 4 млн.п.н. Тем не менее информация, полученная при исследовании абортного материала методом CGH, позволила установить сбалансированную транслокацию у отца, когда дериватная хромосома 16 обнаружена при таргетной FISH с ДНК-зондом на субтеломерный район длинного плеча хромосомы 20. В остальных двух случаях установить происхождение хромосомной аномалии у плода оказалось невозможным.

Результаты использования методов метафазной CGH и FISH анализа для исследования материала неразвивающихся беременностей (n = 146)

Эффекты хромосомных аномалий в онтогенезе

Хромосомные аномалии вызывают нарушение общего генетического баланса, той скоординированности в работе генов и системности регуляции, которые сложились в процессе эволюции каждого вида. Неудивительно, что патологические эффекты хромосомных и геномных мутаций проявляются на всех стадиях онтогенеза и, возможно, даже на уровне гамет, влияя на их формирование (особенно у мужчин).

Изучение первичных эффектов хромосомных аномалий началось в начале 60-х годов вскоре после открытия хромосомных болезней и продолжается до сих пор. Главные эффекты хромосомных аномалий проявляются в двух связанных между собой вариантах: летальности и врожденных пороках развития.

Летальность. Имеются убедительные свидетельства того, что патологические эффекты хромосомных аномалий начинают проявляться уже со стадии зиготы. Летальность – один из главных факторов внутриутробной гибели, достаточно высокой у человека.

Выявить количественный вклад хромосомных аномалий в гибель зигот и бластоцист (первые 2 нед после оплодотворения) в полной мере трудно, поскольку в этот период беременность ни клинически, ни лабораторно еще не диагностируется. Однако некоторые прямые исследования бластоцист и результаты экстраполяций позволяют предположить, что 30-40% оплодотворенных яйцеклеток погибает на стадии зиготы – бластоцисты, т.е. до имплантации и, следовательно, до лабораторного или клинического установления беременности. В этих случаях происходит резкое нарушение ранних морфогенетических процессов (до гаструляции и формирования зародышевых листков). Такие случаи ранней остановки развития можно объяснить тем, что нарушение геномного баланса вследствие развития какой-то определенной формы хромосомной аномалии приводит к дискоординации включения и выключения генов на соответствующей стадии развития (временной фактор) или в соответствующем месте бластоцисты (пространственный фактор). Это вполне понятно: поскольку в процессах развития на ранних стадиях участвуют примерно 1000 генов, локализованных во всех хромосомах, хромосомная аномалия нарушает взаимодействие генов и инактивирует какие-то конкретные процессы развития (межклеточные взаимодействия, дифференцировка клеток и др.).

Многочисленные цитогенетические исследования материала спонтанных абортов, выкидышей и мертворожденных позволяют объективно судить об эффектах разных типов хромосомных аномалий во внутриутробном периоде индивидуального развития. Летальный или дизморфогенетический эффект хромосомных аномалий обнаруживается на всех стадиях внутриутробного онтогенеза (имплантация, эмбриогенез, органогенез, рост и развитие плода). Суммарный вклад хромосомных аномалий во внутриутробную гибель (после имплантации) у человека составляет 45%. При этом чем раньше прерывается беременность, тем вероятнее, что это обусловлено аномалиями развития эмбриона, вызванными хромосомным дисбалансом. У 2-4-недельных абортусов (эмбрион и его оболочки) хромосомные аномалии обнаруживают в 60-70% случаев. В I триместре гестации хромосомные аномалии встречаются у 50% абортусов. У плодов-вькидышей II триместра такие аномалии находят в 25-30% случаев, а у плодов, погибших после 20 нед гестации,- в 7% случаев.

Среди перинатально погибших плодов частота хромосомных аномалий составляет 6%.

Наиболее тяжелые формы по дисбалансу хромосомного набора встречаются у ранних абортусов. Это полиплоидии (25%), полные трисомии по аутосомам (50%). Трисомии по некоторым аутосомам (1; 5; 6; 11; 19) встречаются крайне редко даже у элиминированных эмбрионов и плодов, что свидетельствует о большой морфогенетической значимости этих аутосом. Данные аномалии прерывают развитие в доимплантационном периоде или нарушают гаметогенез.

Высокая морфогенетическая значимость аутосом еще более отчетлива при полных аутосомных моносомиях. Последние редко обнаруживаются даже в материале ранних спонтанных абортов из-за летального эффекта такого дисбаланса.

Врожденные пороки развития. Если хромосомная аномалия не дает летального эффекта на ранних стадиях развития, то ее последствия проявляются в виде врожденных пороков развития. Практически все хромосомные аномалии (кроме сбалансированных) приводят к врожденным порокам развития, сочетания которых известны как нозологические формы хромосомных болезней и синдромов.

хромосомный даун патау тернер

Эффекты однородительских дисомий. Явление однородительских дисомий небезразлично для индивида. Во-первых, может присходить гомозиготизация по рецессивным патологическим генам, т.е. болезнь будет получена от одного родителя. Во-вторых, по некоторым хромосомам однородительские дисомии приводят к синдромам или внутриутробной задержке роста плода в связи с импринтингом локуса в отцовской или материнской хромосоме (моноаллельная, а не биаллельная экспрессия). Примеры влияния однородительских дисомий на развитие индивида приведены в табл.

Таблица Примеры однородительских дисомий человека, приводящих к аномалиям фенотипа

У плода риск хромосомной аномалии. Что делать?

Диагностика хромосомной аномалии плода (ХА).

Наиболее информативен первый скрининг или двойной тест. Его надо делать строго на сроке c 11 по 13 неделю и 6 дней беременности . Он состоит из УЗИ плода (особенно важно правильно оценить толщину воротникового пространства плода, и диагностировать наличие носовых косточек) и анализа крови на РАРР-А и β -ХГЧ.

Заключение скрининга – это не диагноз, так как не дает точного ответа на вопрос о наличии или отсутствии ХА. Его задача — в зависимости от уровня биохимических маркеров, хронических заболеваний, возраста и анамнеза беременной, определить группы риска женщин (низкий, средний, высокий), по той или иной хромосомной или врождённой аномалии развития плода. Второй скрининг, «тройной тест» или «четверной тест», проводимый с 16 по 18 неделю беременности, не информативен для выявления ХА, в большей степени подтверждает наличие врождённой аномалии плода (пороки развития).

Маркеры скринингов 1 и 2 триместров, используются также при прогнозировании поздних осложнений беременности .

Узнать точно, есть ли у ребеночка ХА, можно только при помощи инвазивных методов — биопсии хориона, забора пуповинной крови, анализа амниотической жидкости.

Цель этих анализов — определение кариотипа плода. Точность — 98%. Риск выкидыша — 1-2%. ХА не лечатся. После выявления ХА все, что может предложить медицина, — прерывание беременности.

Причины возникновения ХА

Однозначных причин возникновения ХА не известно. Повышенный риск существует, если:

— возраст матери и отца превышает 35 лет,

— есть ХА у кровных родственников,

— есть сбалансированная транслокация у кровных родственников или у родителей,

— родители работают на вредных производствах, семья проживает в экологически неблагополучном районе

— воздействие радиации, излучения на малых срока беременности

Механизм возникновения ХА

ХА возникает у плода в момент образования зиготы, т.е. при слиянии яйцеклетки и сперматозоида. Материнская и отцовская клетка несут по 23 хромосомы (23 от мамы и 23 от папы). Обе клетки могут уже нести в себе «ломаные» хромосомы (даже если мама и папа абсолютно здоровы). Сбой может произойти и в момент слияния двух абсолютно здоровых родительских клеток. В этом случае «расходятся» неверно хромосомы плода. Этот процесс еще не изучен и не поддается контролю.

Изучено и описано более 300 хромосомных синдромов.

Учитывая, что у человека 23 парных хромосомы и существует несколько видов аберрации, количество хромосомных синдромов, не описанных в литературе и возникающих вновь, не ограничено!

Аберрации могут быть разные: полные и частичные трисомии, делеции, моносомии, мозаицизм транслокации и т.д. Выраженность признаков при хромосомном синдроме зависит от вида аберрации. Самый благоприятный вид — сбалансированная транслокация. Люди с такими изменениями ничем не отличаются от обычных, их особенность может быть выявлена только путем кариотипирования, однако у них повышен риск рождения детей с хромосомными синдромами — от 10 до 50% (средний риск в популяции — 5%).

Следующий наименее «травматичный» вид аберрации — мозаицизм, при котором хромосомное нарушение проявляется не во всех клетках и/или органах. Частичные трисомии и делеции дают уже значительные пороки развития, порой не совместимые с жизнью.

Самый тяжелый вид — полная трисомия или моносомия хромосомы.

Большая часть беременностей с хромосомной патологией плода отторгается самим организмом на самых ранних сроках или на сроке 20-23 недели, так как при хромосомной патологии плода велика вероятность различных патологий беременности (невынашивание, угроза выкидыша, гипертонус матки, преждевременное старение плаценты, токсикоз, гестоз, гипоксия плода и т.д.). Также многие малыши не доживают до года ввиду множественных пороков развития. Средняя продолжительность жизни людей с ХА — 30 лет, но есть описанные случаи пациентов с ХА доживших до 60 лет и более.

Люди с хромосомными синдромами могут быть как тяжелыми инвалидами, так и абсолютно полноценными членами общества, получившими полноценное образование и имеющими обычную работу. Все зависит от вида аберрации, общего состояния организма и труда родных и близких. В большинстве случаев люди с хромосомными синдромами могут себя обслуживать, общаться, выполнять посильную работу. Интеллект снижен, есть хронические заболевания органов и систем организма.

Источники:

http://science-education.ru/article/view?id=25286
http://studwood.ru/1908452/meditsina/effekty_hromosomnyh_anomaliy_ontogeneze
http://m.baby.ru/sp/28168158/blog/post/89425609/